Поддержание четвертичной структуры в замороженном состоянии стабилизирует лактатдегидрогеназы в процессе лиофилизации

yophilization ( сублимационной сушки ) является распространенным методом для подготовки образцов белка для долговременного хранения . Тем не менее, замораживания и сушки сами процессы могут привести к денатурации белка . Сохранение структуры и функции белка во время лиофилизации требует стабилизации против обоих замораживания и сушки с соответствующими добавками , которые защищают белки во время этих напряжений на совершенно разных механизмов . Защита при замораживании происходит по тому же механизму , что и для термодинамического стабилизации нативной структуры белка в незамерзшей решения , т. е. преимущественного растворенного исключения . Как описано Тимашева и его коллегами , добавок , которые предпочтительно исключить из поверхности белка повысить химический потенциал белка ; величины обоих эффектов прямо пропорциональны площади поверхности белок . Поскольку белок разворачивается увеличивает площадь поверхности белка , в присутствии растворенных веществ предпочтительно исключенных свободная энергия разворачивается увеличивается. Предпочтительно , исключенные растворенные вещества могут также стабилизировать четвертичную структуру , поскольку в сочетании площадь поверхности диссоциированных субъединиц больше, чем для полностью собранного белка. Кроме того, учитывая, что holoenzymes , как известно, более стабильны, чем диссоциированных субъединиц , предпочтительно исключены растворенные вещества потенциально могут обеспечить дополнительную стабилизацию мультимерных белков при поддержании полностью собранном
Льготный механизм растворенного вещества исключение не распространяется на защиту белков при дегидратации . Напротив, эффективные стабилизаторы , такие как сахара ингибируют дегидратации , вызванной белок разворачивается путем замены воды и водородных связей непосредственно к высушенному белка. В противоположность этому, полимерные добавки (например , поливинилпирролидон, декстран, полиэтиленгликоль) являются стерически затрудненными от эффективно водородных связей с поверхности сухой белок и не могут непосредственно ингибировать индуцированную обезвоживание белок разворачивается . Кроме того, поверхностно-активные вещества представляют собой класс стабилизаторов , что не защищают с помощью льготного механизма исключения или водородных связей. В очевидной противоречие с этим наблюдением , Хеллман и др. . Сообщается, что поливинилпирролидон же защитить мультимерный как paraginase во время лиофилизации . Этот результат позволяет предположить, что полимеры защищают белки в процессе сушки с помощью способа , кроме замены воды. Хеллман и др. . использовали систему натрий-фосфатного буфера , который , как известно, значительно подкисляют при замораживании из-за осаждения Na2HPO4 . Совсем недавно, с использованием лактатдегидрогеназы (ЛДГ ) 2 в качестве модельного мультимерного белка , мы показали, что этот фермент способствует подкисление диссоциации в замороженном состоянии , что приводит к дальнейшему необратимой денатурации в течение последующей сушкой . Кроме того, наша предыдущая работа показывает, что полимеры (например , поливинилпирролидон ) образуют очки , которые не позволяют подкисление буфера и, как следствие диссоциации при замораживании . Таким образом, наблюдаемое увеличение восстановления после лиофилизации в результате способности полимеров для предотвращения подкисления и сохранения четвертичную структуру в замороженном состоянии . Кроме того, мы предположили, что льготная исключение полимеров с поверхности СДГ также способствует поддержанию четвертичной структуры в замороженном состоянии . Соответственно, предпочтительно исключить растворенные вещества (например, полимеры , сахара ) следует предотвратить замерзание -индуцированной диссоциации , которое происходит в отсутствие подкисления буфера , и , как следствие, стабильность белков во время последующей сушки должна быть увеличена. Чтобы проверить эту гипотезу , в данном исследовании мы использовали два электрофореза различных изоформ ЛДГ растворенные в буферной системе фосфат - KI калия , который способствует диссоциации но не подкисления при замораживании . Наши эксперименты контролировать четвертичного структуру и активность фермента на разных стадиях замерзания & Ndash ; процесс сушки , чтобы оценить способность диапазоне добавок ( сахара , полимеры, и поверхностно-активные вещества ), чтобы предотвратить фермента диссоциации и сохранения активности ЛДГ .